2017, Vol. 30
梳形共聚物是指一类支链以等间距、等长度方式接枝到主链的高接枝密度的共聚物, 一般具有梳状或者蠕虫状的整体形状, 接枝链间的空间位阻导致主链和接枝链伸展充分, 使得梳形共聚物具有一些特殊的性质和应用[1-9]。
梳形共聚物通常有3种合成途径, 分别为"graft-from"、"graft-onto"和"graft-through"。"graft-from"是首先通过化学改性主链骨架而在主链上引入引发基团, 然后通过相应的聚合机制在主链上引发接枝单体的聚合, 该途径也可实现主、支链的结构控制, 但是主链的引发效率和接枝生长链的副反应是需要考虑的不利因素[10-14]。"graft-onto"是通过主、支链间的化学反应将支链接枝到主链骨架链上而得到梳形共聚物, 其主链和接枝链的分子量及其分布能有效地获得控制, 但是接枝密度会受到一定限制[15-18]。"graft-through"是先合成末端可聚合的接枝链大分子单体, 再进行上述大分子单体的聚合, 从而制备得到梳形聚合物, 这种方法的缺陷在于主链聚合度受到限制[19-21]。
随着活性聚合方法和点击化学等高效化学反应的研究深入, 梳形共聚物也获得了长足发展, 接枝链由单一组分发展到多组分, 包括不同均聚物的接枝链、嵌段型的接枝链和V型接枝链[22-27]。如Liu等[24]制备的双亲性梳形聚合物, 其接枝链分别是具有pH响应性的聚(N, N-二乙基丙烯酰胺)(PDEA)接枝链和具有温度响应性的聚(二乙二醇单甲醚)甲基丙烯酸酯(PMOE2MA)接枝链。Wang[3]等在同一支化点通过羟基和叠氮基团分别引入聚(乙基乙烯基磷酸酯)和聚己内酯, 获得V型梳形共聚物。
双亲性共聚物本身具有表面活性, 也可使油水混合体系形成水包油型乳液。利用双亲支链梳形共聚物的自乳化能力负载药物, 有望实现药物的高效负载。此过程不需要传统的小分子乳化剂, 形成的载药乳胶粒子更稳定, 并可通过改变接枝链的结构来增强负载能力、改善纳米药物的生物相容性, 还可通过接枝链的降解控制药物的释放, 因而通过双亲支链梳形共聚物自乳化制备药物制剂具有便捷、高效、低危害等优势。
本文利用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合获得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA), 通过叠氮钠与环氧基团的反应引入叠氮基、羟基, 通过端炔基聚乙二醇(PEG-alk)与叠氮基的点击反应及己内酯(ε-CL)在羟基存在下的开环聚合反应, 依次高效接枝PEG和PCL支链, 从而获得每个主链结构单元含有两个接枝链的双亲支链梳形共聚物PGMA-g-PEG/PCL。利用该梳形共聚物两亲性的自乳化能力, 在氯仿-水混合体系中, 实现阿霉素(DOX)的高效负载, 利用PCL接枝链的降解实现在不同pH条件下的可控释放。
1 实验部分 1.1 试剂甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA, Aldrich公司)在对苯二酚存在下减压蒸馏纯化; 聚乙二醇(PEG, Mn=2 000, BASF公司)和己内酯(ε-CL, Sigma-Aldrich公司)真空干燥后使用; 4, 4'-偶氮二-4-氰基戊酸(ACVA, Aldrich公司)和偶氮二异丁腈经重结晶纯化; 五甲基二乙烯三胺(PMDETA, Aldrich公司)在加入NaOH后蒸馏纯化; 溴化亚铜用甲醇和乙醚洗涤后真空干燥; 四氢呋喃(THF)在钠/二苯甲酮存在下回流至深蓝色后蒸馏出, 二氯甲烷在氢化钙存在下回流24 h后蒸馏出, 三乙胺用固体KOH干燥, 这3种试剂皆为分析纯; 4-氰基-4-(2-苯乙基硫烷基硫代羰基)硫代烷基戊酸(PETTC)按文献方法合成[28]。其他试剂均购自Sigma-Aldrich, 直接使用。
1.2 PGMA-g-PEG/PCL的制备图 1为PGMA-g-PEG/PCL梳形共聚物的合成路线示意图。首先通过RAFT聚合得到PGMA, 经叠氮钠开环氧基团得到PGMA-OH/N3, 利用叠氮-炔的点击反应"graft-onto"接枝PEG, 最后以Sn(Oct)2为引发剂进行开环聚合, "graft-from"接枝PCL, 获得最终产物。
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图 1 双亲支链梳形共聚物PGMA-g-PEG/PCL的合成示意图 Fig. 1 Schematic illustration for preparing amphiphilic centipede-like PGMA-g-PEG/PCL |
1.2.1 PGMA的RAFT聚合
向装有磁子的封管中加入GMA(3.60 g, 25.3 mmol)、RAFT试剂PETTC (170.4 mg, 0.5 mmol)和THF (20 mL), 经过3次冷冻-真空-解冻的脱气过程后加入引发剂AIBN(16.4 mg, 0.1 mmol), 在真空条件下封管, 室温下反应12 h。反应结束后, 液氮冷冻终止反应, 融化后再在冰乙醚中沉淀, 纯化3次, 真空干燥过夜, 得到目标产物PGMA, 收率80%。
1.2.2 PGMA-OH/N3的制备将PGMA(1.30 g, 9.15 mmol环氧基团)、DMF(60 mL)、叠氮钠(1.79 g, 27.45 mmol)和氯化铵(1.47 g, 27.45 mmol)加入到单口烧瓶中, 50 ℃下反应36 h。减压蒸馏除去溶剂, 再用THF(50 mL)溶解产物, 过滤, 滤液用无水乙醚沉淀, 纯化3次, 真空干燥过夜, 得到每个结构单元皆含有1个羟基和叠氮基的PGMA(PGMA-OH/N3), 收率85%。
1.2.3 PEG-alk的制备将单羟基封端PEG(4.50 g, 2.25 mmol)溶解在甲苯(60 mL)中, 加入丙炔醇(3.5 g, 0.05 mol)和对甲苯磺酸一水化合物(0.2 g), 130 ℃回流反应24 h, 过滤除去不溶物, 在冰乙醚中沉淀, 过滤收集产物, 真空干燥过夜, 得到PEG-alk, 收率95%。
1.2.4 点击反应制备梳形共聚物PGMA-g-OH/PEG向装有磁子的50 mL封管中分别加入PGMA-OH/N3(0.8 g, 4.4 mmol)、PMDETA (24 mg, 0.14 mmol)、PEG-alk(0.9 g, 0.45 mmol)和DMF(28 mL), 充分混合, 经过3次循环冷冻-真空-解冻脱气后, 在40 ℃下反应24 h。反应混合物在EDTA-Na的去离子水溶液中用透析袋(Mw, cutoff=3 500) 透析7 d, 经冷冻干燥得到白色固体, 产物命名为PGMA-g-OH/PEG, 收率为80%。
1.2.5 开环聚合制备双亲支链梳形共聚物PGMA-g-PEG/PCL将PGMA-g-OH/PEG (0.5 g, 0.23 mmol的羟基)干燥过夜。己内酯(1.8 g, 15.8 mmol)和甲苯(15 mL)以CaH2回流12 h, 减压蒸馏, 再将收集到的馏分加入到充分干燥的三口烧瓶中, 在通氮、搅拌条件下加入Sn(Oct)2(20 mg, 0.05 mmol), 85 ℃反应12 h, 反应体系用THF作为洗脱剂过中性氧化铝柱子, 在冰乙醚中沉淀, 如此纯化3次后, 真空干燥过夜, 得到产物PGMA-g-PEG/PCL, 收率55%。
1.3 PGMA-g-PEG/PCL自乳化负载DOX将PGMA-g-PEG/PCL(20 mg)溶解在氯仿(20 mL)中, 加入DOX·HCl(4 mg)和三乙胺(TEA, 0.05 mL), 室温搅拌1 h。在快速机械搅拌下, 逐滴加入去离子水50 mL, 继续搅拌12 h后超声处理(每隔10 s超声30 s, 循环6次)。在室温下自然挥发24 h, 室温减压10 min以彻底除去氯仿, 得到自乳化乳液, 取少量乳液并适当稀释, 用动态光散射测定粒径。将该乳液用透析袋(Mw, cutoff=3 500) 在去离子水中透析3 d, 除去未有效包载的药物和三乙胺等杂质, 冷冻干燥后得到粉红色的负载DOX的粉末。取少量样品, 以DMF溶解并定容, 用UV-Vis光谱测定药物负载量。
1.4 负载DOX粒子的药物释放取2 mg负载DOX粒子分散于5 mL去离子水中, 然后加入到透析袋(Mw, cutoff＝3 500) 中, 在100 mL的去离子水中进行药物释放。每隔一段时间从透析液中取出5 mL溶液作为待测样品, 并补充5 mL去离子水, 以维持透析液体积恒定, 用UV-Vis光谱测定待测样品的药物浓度。按照相同程序, 在pH=5.0的HCl水溶液中进行药物释放, 补充的透析液为pH=5.0的HCl水溶液。待药物释放2 d后停止透析, 并取出残留固体混合液, 冷冻干燥后, 进行扫描电镜观察。
1.5 表征和测试用Bruke 300 MHz核磁共振仪测定核磁共振氢谱, 根据聚合物类型选用不同氘代试剂, 内标为四甲基硅烷; 在VECTOR-22傅里叶变换红外光谱仪上获得FT-IR谱图, KBr压片法制样; 利用Unico UV/Vis2802PCS分光光度计测定紫外-可见(UV-Vis)光谱; 聚合物的分子量及其分布由Agilent 1260凝胶渗透色谱仪测定, 装配PLgel色谱柱(300 mm×7.5 mm)和RI检测器, 以单分散聚苯乙烯为标样、THF为洗脱剂, 流速为1.0 mL/min; 动态光散射测试在ALV/DLS/SLS-5022F型激光光散射仪上完成, 光源为λ=653 nm的氦-氖激光器, 样品经0.45 μm的PTFE Millipore膜除尘, 30°下收集散射光, 测定时间10 min; 将负载DOX的粉末样品黏附在双面胶带上, 真空镀金, 用场发射扫描电子显微镜(SIRION-200) 观察, 加速电压为5 kV。
2 结果与结论 2.1 PGMA的RAFT聚合图 2(a)为PGMA的核磁共振氢谱图, 其中信号峰a和b对应于环氧基团的亚甲基氢和次甲基氢, 积分高度比刚好为2;信号峰f对应于苯环旁的亚甲基质子, 其积分高度与信号峰b的比值为65, 说明PGMA的核磁数均聚合度为65, 核磁数均分子量(Mn, NMR)为9 000。图 3(a)显示PGMA的分子量分布, 表观数均分子量(Mn, GPC)为1.5×104, 分子量分布指数为1.21。核磁和GPC的表征数据列入表 1。
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a—PGMA in CDCl3; b—PGMA-OH/N3 in DMSO-d6; c—PGMA-g-OH/PEG in D2O; d—PGMA-g-PEG/PCL in DMSO-d6 图 2 聚合物的核磁共振氢谱图 Fig. 2 1H-NMR spectra of samples |
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表 1 双亲支链梳形共聚物PGMA-g-PCL/PEG及其前体聚合物的表征 Table 1 Characterization of amphiphilic centipede-like PGMA-g-PCL/PEG and its precursors |
2.2 PGMA-OH/N3的制备
PGMA-OH/N3的核磁氢谱如图 2(b)所示。在化学位移为2.6、2.9和3.2处的环氧基团特征峰完全消失, 在不同化学位移处出现新的信号, 说明所有环氧基团都参与了开环反应。从PGMA-OH/N3的红外吸收光谱图(图 4(a))可以看出, 2 110 cm-1处明显存在叠氮基团的特征吸收, 说明叠氮基团成功引入。
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图 4 PGMA-OH/N3 (a)、PGMA-g-OH/PEG (b)和PGMA-g-PEG/PCL (c)的傅里叶红外光谱 Fig. 4 FT-IR spectra of PGMA-OH/N3 (a), PGMA-g-OH/PEG (b) and PGMA-g-PEG/PCL (c) |
2.3 单端炔基PEG的制备
利用单羟基PEG和丙炔酸的酯化得到单端炔基的PEG-alk。图 5(a)为其核磁共振图谱, b峰、c峰和d峰分别对应于PEG的亚甲基氢、与酯基相邻的亚甲基氢和炔基氢, 其比例为180:2:1, 与理论值吻合, 说明酯化程度完全。在PEG-alk的红外光谱(图 5(b))中出现了1 680 cm-1处的酯羰基特征峰和3 300 cm-1处的炔基特征峰, 也证明了炔基的引入。
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图 5 端炔基PEG的核磁共振氢谱(a, CDCl3为溶剂)和傅里叶红外光谱(b) Fig. 5 1H-NMR (a) and FT-IR (b) spectra of PEG-alk (NMR solvent: CDCl3) |
2.4 PGMA-g-OH/PEG的制备
本文利用点击化学反应的高效性来消除因位阻带来的接枝不完全的影响。图 2(c)为PGMA-g-OH/PEG的核磁共振氢谱, 由图可以清楚看到化学位移为5.5处的新信号峰归属于与三唑环相连的亚甲基质子(信号b), 通过该峰与0.9附近的主链甲基峰(信号e)的积分高度比, 确定95%的叠氮基团参与点击反应, 即叠氮基接枝率(Eclick)高达95%。由化学位移为3.5处的PEG亚甲基信号和主链甲基峰的信号也能得到此结果, 计算式为式(1)。图 4(b)为其红外光谱, 原2 110 cm-1处的叠氮峰基本消失, 说明叠氮基团基本参与点击反应。图 3(b)为PGMA-g-OH/PEG的GPC曲线, 反映出接枝PEG后表观分子量明显增加, 但是仍保持较窄的分子量分布, 相关数据见表 1。
| $ {{E}_\text{click}}=3{{I}_{a}}/\left( 4{{D}_{\text{NMR}}}\times {{I}_{\text{c}}} \right) $ | (1) |
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图 3 PGMA (a)、PGMA-g-OH/PEG (b)和PGMA-g-PCL/PEG (c)的GPC曲线 Fig. 3 GPC traces of PGMA (a), PGMA-g-OH/PEG (b) and PGMA-g-PCL/PEG (c) |
其中:Ia和Ie分别是a峰和e峰的积分高度, DNMR为PEG的聚合度。
2.5 PGMA-g-PCL/PEG的制备由于PGMA-g-OH/PEG高密度接枝了PEG, 使得再接枝其他支链的难度大大增加, 为此利用graft-from法, 通过开环聚合接枝可降解的PCL支链。图 2(d)为PGMA-g-PCL/PEG的核磁共振氢谱, 其中新信号峰(4.16, i)为PCL接枝链与酯基氧原子相邻的亚甲基峰, 原处于3.3处与羟基相邻的次甲基峰完全消失, 证实PGMA-g-OH/PEG的所有羟基都参与阳离子聚合。根据PCL的亚甲基i峰(4.16) 和PEG的亚甲基a峰(3.75) 的积分高度, 由公式(2) 得出PCL的聚合度为40。图 4(c)为PGMA-g-PCL/PEG的红外光谱图, 可看到1 680 cm-1处酯羰基的吸收峰明显增强, 而且在680 cm-1处出现属于多亚甲基的特征吸收峰, 证明PCL已成功引入。图 3(c)为PGMA-g-PCL/PEG的GPC曲线, 表观分子量进一步向高分子量侧移动, 分子量分布依然较窄, 相关数据列入表 1。
| $ {{D}_{\text{PCL}}}=\frac{3{{I}_\text{i}}}{2{{I}_\text{a}}} $ | (2) |
其中: DPCL为接枝链PCL的聚合度, Ii和Ia分别为4.16和3.75处信号峰的积分高度。
2.6 梳形聚合物的自乳化负载DOX和药物释放行为有关梳形聚合物的药物释放体系已有较多文献报道, 但是大部分利用自组装进行药物负载, 再通过其响应性来进行释放。自组装药物负载是首先将两亲性共聚物溶解于共同的良溶剂中, 然后再与选择性溶剂混合, 要求共同的良溶剂和选择性溶剂是互溶的。在自组装过程中, 过高的共聚物起始浓度易导致相分离速率加快, 从而形成粒径较大、稳定性不够的粒子, 同时对于疏水性药物而言, 过快溶剂混合也会导致呈溶解状态的药物快速聚集。
本文利用PGMA-g-PCL/PEG的自乳化进行高效药物包载, 然后利用接枝链PCL的可降解性实现可控药物释放, 如图 6所示。首先, 将双亲性梳形共聚物和药物共溶解于低沸点有机溶剂氯仿中, 微量三乙胺的加入可确保药物完全溶解; 然后将去离子水缓慢加入, 快速搅拌进行自乳化而形成乳胶粒子; 经过溶剂挥发得到负载药物的纳米粒子。自乳化负载药物利用两亲性共聚物的表-界面活性将水、油两相体系乳化成动力学稳定的分散体系, 药物始终保留在疏水性油相, 两亲性共聚物以较缓的速率扩散至水、油界面, 油相在剪切力的作用和两亲性共聚物的稳定下被分散。因此, 相对于自组装途径, 自乳化法有望达到高的载药率。为确保未包载药物和其他杂质的彻底去除, 特别在去离子水中先透析3 d, 此时, 负载DOX纳米粒子的药物负载率达到17.7%, 即1 g载药胶粒含有0.177 g药物, 这个数据比其他文献[27, 29-30]的DOX载药率15%要高。
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图 6 双亲支链梳形共聚物PGMA-g-PCL/PEG自乳化负载DOX和PCL接枝链降解控制DOX释放示意图 Fig. 6 Schematic depiction of DOX loading through self-emulsification of amphiphilic centipede-like PGMA-g-PCL/PEG and controlled release through PCL degradation |
图 7(a)中的插图为负载DOX乳胶粒子的流体力学半径(Rh)分布曲线, Rh的平均值为100 nm左右, 且分布比较窄。图 7(a)为冷冻干燥后载药粒子的扫描电镜照片, 可以看出自乳化后的载药粒子颗粒分明, 尺寸分布均匀, 直径在180 nm左右。图 7(b)为酸性条件下药物释放35 h后的残余物的扫描电镜照片, 大部分的颗粒已经解体成膜状物, 这是由于PCL嵌段降解后的产物PGMA-g-PEG不能在水溶液中聚集, 膜状物中可分辨出少许残留颗粒所致。
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图 7 负载DOX纳米粒子在pH=5.0的水溶液中释放前(a)、后(b)的SEM照片(插图为负载DOX纳米粒子在释放前的流体力学半径分布) Fig. 7 SEM photos of DOX-loading nanoparticles before (a) and after (b) drug release at pH=5.0 solution (inserted figure: Rh distribution of DOX-loading nanoparticles) |
对自乳化载药颗粒进行药物释放实验, 得到的药物释放曲线如图 8所示。在中性条件下, DOX的累计释放量逐渐增加, 在40 h内才接近50%左右。当pH=5时, 由于PCL的降解, 药物的累计释放量明显增加, 在前5 h快速增加至43%, 随后持续增加, 至36 h时达到82%。
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图 8 负载DOX纳米粒子的累计释放情况 Fig. 8 Cumulative drug release from DOX-loading nanoparticles |
3 结论
(1) 利用RAFT聚合得到PGMA, 进而在其侧基上引入叠氮基、羟基。结合端炔基聚乙二醇与叠氮基的点击反应及己内酯在羟基存在下的开环聚合反应, 依次在PGMA上引入PEG和PCL接枝链, 成功制得双亲支链的梳形共聚物。
(2) 利用该梳形共聚物的双亲性, 在氯仿-水混合体系中, 自乳化负载DOX, 得到负载DOX的载药纳米粒子, 该纳米粒子的药物负载率达到17.7%, 即1 g载药胶粒含有0.177 g药物, 其尺寸分布均匀, 平均粒径约为100 nm。
(3) 该载药粒子在pH为7.0和5.0的水溶液中能有效释放DOX, 且在酸性条件下释放速率加快, 并伴随PCL的降解。
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